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주제 : 단백질 분리정제 및 기능분석
실험일시 : 2008년 3월 11일 2:00p.m.~ 4:30p.m.
목적 : Column chromatography의 준비로서의 buffer만들기
실험목표 : 1M의 Tris-HCl (pH7.4), NaCl, MgSO4 Stock solution을 제조한 후 다양한 NaCl 농도의 elution buffer를 만든다.
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buffer란 무엇인가?
-2. 몰농도(M)의 개념
-3. pH미터기 사용법/ 주의사항
-4. pH/pKa
5. 실험도구
pH 미터기, Tris 가루, HCl, 증류수, 마그네틱 바, stirier, spatula, pipette(1ml), 메스실린더 (50ml이상), 비커, 전자저울, 비닐장갑, weight paper, 50ml튜브
6. 실
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Buffer Solution)
완충용액(buffer or buffer solution)이란 산 혹은 염기가 첨가 되었을 때 용액의 pH가 거의 변화하지 않는 용액을 말한다. 전형적으로 완충계는 약산과 그 짝염기로 구성되며 pKa값과 거의 동일한 pH를 가진 약산의 용액을 말한다.
완충
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50ml인 것을 이용해 연립방정식을 풀면 표를 채울 수 있다.
30mM
NaCl
100mM
NaCl
150mM
NaCl
200mM
NaCl
Elution
Buffer A
aml
aml
aml
aml
Elution
Buffer B
bml
bml
bml
bml
Total
Volume
50ml
50ml
50ml
50ml
①aml10mM+bml1000mM=50ml30mM
a+b=50
a=48.99, b=1.01
②aml10mM+bml1000mM=50ml100mM
a+b=50
a=45.45,
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buffer
2) buffer의 pH를 구할 수 있는 equation: Henderson Hassalbalch equation
3) 몰농도
4) buffer를 만드는 법, 계산과정
5)실험도구 및 과정
2. ion-exchange column chromatography
1)column chromatography의 원리
2)resin
-anion exchanger
-cation exchanger
3)elution (용출)
4)posit
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buffer를 이용하여 부수어서 amylase 등 기타물질을 얻는다.
3.Centrifugation
Suspension viscosity 감소를 위해 Cell debris와 DNA-PEI complexes를 제거한다.
4.IEX-EBA Chromatography
chromatography하기 앞서 loading하는 용액이 equilibration 단계의 buffer A와 같은 조건이 되
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column 을 사용할 수 있기 때문에 분리능이 크다는 것과 정지상과 이동상 사이에 시료의 성 분이 확산속도가 크므로 분석시간이 비교적 짧다는 것이다.
단점 : ① 검출기는 모든 시료성분에 대하여 동일하게 정량적으로 감응해야한다. 그러므
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