장 정도면 충분)을 유발에 넣고 아세톤 5mL를 첨가한 후, 막자사발로 곱게 간다.
② 세포잔사를 제거하지 않은 상태에서 다음 단계인 크로마토그래피에 사용한다.
2. 크로마토그래피에 의한 색소의 분획
① 여과지를 15 x 2cm 되게 자른다. 아래 그림과 같이 1cm되는 곳을 잘라 삼각형을 만든 다음 이곳으로부터 2cm되는 곳에 연필로 선을 긋는다. 이 때 여과지를 손으로 만지지 않도록 한다.
② 모세관을 이용하여 준비된 엽록소 추출액을 연필로 그은 선 중앙에 점적한다.
③ 핀으로 여과지를 시험관 마개에 매달고 전개 용매가 들어있는 시험관에 넣는다. 여과지 가 시험관 벽면에 달지 않도록 주의하고 전개용매의 끝에서 0.5cm정도 잠기도록 한다.
④ 전개액이 여과지 위에서 충분히 전개될 때까지 기다린다.
⑤ 점적한 부분에서 가장 가까운 곳의 노란색을 띤 녹샌의 밴드가 엽록소b이고 그 위에 푸른색을 띤 녹색밴드가 엽록소a이며 그 위쪽으로 몇 개의 크산토필 밴드가 나타난다. 전개액이 전개된 가장 위쪽의 노란색 밴드가 카로틴이다.
⑥ 다른 색소 밴드가 섞이지 않도록 주의하며 엽록소a를 잘라 내어 시험관에 넣고 아세톤 2mL을 부어 유리막대로 잘 저어준다.
⑦ 분광광도계를 이용하여 380nm에서 700nm까지의 파장에서 20nm 간격으로 흡광도를 측정하여 그래프를 그리고 최대흡수파장을 알아본다.
3. 엽록소의 함량 측정
① 시금치 잎에서 추출한 엽록소a와 엽록소b의 혼합물을 아세톤으로 적당히 희석하고 분광광도계를 이용하여 645nm와 663nm에서 흡광도를 측정한다.
② 식을 이용하여 엽록소의 함량을 구한다.
광합성과 크로마토 그래피 결과레포트
Date. 14.05.13
Sub Date. 14.05.17
목적. 크로마토그래피의 원리를 이해하고, 종이 크로마토그래피법을 이용하여 식물의 색소를 분리하여 본다.
결과.
색소
색깔
엽록소 a
청록색
엽록소b
황록색
카로틴 (Carotene)
황색
크산토필 (xanthophyll)
적황색
시금치 잎에서 분리된 색소는 어떤 색깔을 나타내는지 기입하시오.
2. 각색소의 이동거리와 전개율을 계산하고, 다른 조의 결과와 비교해 보시오.
3. 실험결과가 나타난 크로마토그래피 사진을 붙이고, 각 밴드가 나타내는 색소를 표시하시오.
고찰.
이번 실험은 시금치를 이용해 식물의 가장 큰 특징인 엽록소를 분리해보고 알아보는 실험 이였다. 실험에서의 특징은 예비보고서를 쓸 때나 다른 참고문헌과 달리 크산토필이나 카로틴이 관찰되지 못하였다. 또한 엽록소 a,b의 위치 또한 용매전선 부근까지 올라가 관찰 되었다. 그 이유는 에테르의 특성상 진행속도가 높다. 때문에 엽록소 a,b의 위치 또한 속도를 따라 올라가 위치의 이동이 생긴 것 이다. 먼저 실험은 시금치 잎을 추출하는 과정부터 시작하였다. 막사발을 이용해 시금치를 추출 하였는데 ▲중간중간 메탄올 혹은 아세톤을 넣어가며 추출하였다. 그 이유는 무엇인가? 이유는 엽록소는 지용성 색소이다. 때문에 엽록체 속에 들어 있는 색소를 추출해 내기 위해서 수용성 물질인 메탄올 혹은 아세톤을 넣은 것이다. 다음 추출된 색소를 이용해 크로마토그래피 여과지 위에 원점을 기준하고 추출액을 여러번 찍어 진하게 하였다. ▲원점에 색소 추출액을 찍을 때 여러번 찍어 진하게 하는 이유는 무엇인가? 광합성 색소의 분리된 형태를 더 확실히 나타내 주기 위한 것이다. 점을 진하게 찍는다는 것은 많은 양의 색소들이 그곳에 모여 있다는 것이고, 그것이 결국 분리가 되었을 때 각각 분리된 종류별 색소의 양도 많아지기 때문에 크로마토그래피의 결과물이 확연히 나타나게 되는 것이다. 이후 전개용매를 이용해 색소를 관찰하였다. 이들 색소는 특성에 따라 전개 되었다. ▲색소간의 이동거리가 다른 이유에 대해 알아보자. 그 이유는 엽록소의 특성 또는 실험 조건에 따라 달라 질 수 있다. 예를 들면 색소 분자의 크기, 여과지에 대한 흡착력, 전개 액에 대한 용해성 등을 나열 할 수 있다. 광합성을 통해 식물이 성장하고 성장의 주축이 되는 엽록소를 분리하는 과정에서 궁금증이 생겼다. 식물은 엽록소를 통해 성장하고 초록색의 잎을 갖는 것이 특징인데, ▲그렇다면 가을에 빨갛게 물이 드는 단풍의 원리는 무엇인가? 그 이유는 기온이 낮아지면 엽록소가 분해된다. 따라서 실험에서 보이지 않았던 카로티노이드계 색소나 안토시아닌 등의 색소가 돋보이기 때문이다. 그렇다면 실험에서 관찰하지 못하였던 ▲카로틴과 크산토필의 차이점에 대해 알아보도록 하자. 이 둘은 엽록소가 잘 흡수하지 못하는 다른 파장의 빛 에너지 흡수하여 반응중심의 엽록소로 전달해 주고 엽록소a가 강한 빛에 파괴되지 않도록 빛E를 분산, 보호해 주는데 여기서 카로틴(C40 H66)은 과도한 빛에너지를 엽록소 대신 흡수하여 열로 방출시켜버리고, 크산토필(C40 H66 O2)이 도와 주는 역할을한다.
크로마토그래피 실험은 사실 생물, 일반화학, 유기화학 실험 등에서 실험하였다. 이 때 사용한 크로마토그래피는 비슷하기도, 다른 양상을 보였는데, ▲크로마토그래피의 종류에 대해 알아보았다. 첫 번째, 기체 크로마토그래피 이다. 가스 크로마토그래피라고도 한다. 기체를 사용하여, 혼합 기체 시료를 그 성분 기체의 열전도율의 차를 이용하여 검출ㆍ정량하는 기기 분석법이다. 두 번째, 박층 크로마토그래피이다. 유리판 위에 얇게 흡착제의 층을 만들어 이것에 용매를 지나가게 하여 분리한다. 세 번째, 박층 크로마토그래피 : 유리판 위에 얇게 흡착제의 층을 만들어 이것에 용매를 지나가게 하여 분리한다. 네 번째, 이번 실험에서 사용한 종이 크로마토그래피 기법이다. 다섯 번째, 박층 크로마토그래피 : 유리판 위에 얇게 흡착제의 층을 만들어 이것에 용매를 지나가게 하여 분리한다. 마지막으로 박층 크로마토그래피 : 유리판 위에 얇게 흡착제의 층을 만들어 이것에 용매를 지나가게 하여 분리한다.
이번 실험은 크로마토그래피를 가장 잘 이해 할 수 있었고 엽록소를 분리하는 과정을 통해 다시 한 번 식물세포의 특징을 공부할 수 있는 실험 이였다.
출처
On-Kweather, 「단풍은 왜, 어떻게 생기는 걸까, YTN science, 2013